Atlas
 

Další možnosti zpracování tkání, speciální metody



5  Laboratorní metody v patologii

5.3  Další možnosti zpracování tkání, speciální metody

Kromě výše popsaných standardních metod má patolog k dispozici řadu metod speciálních. Některé vyžadují kompletně odchylné zpracování tkáně (například je nutné se vyhnout fixaci, parafinovému procesu) nebo se jedná jen o různé způsoby barvení řezů pořízených z parafinových bloků.

Používaných metod je celá řada. Nemá smysl tyto metody podrobně rozvádět ve výukovém textu, dále uvádíme jen ty nejdůležitější. Je třeba si uvědomit, jaké možnosti patolog při vyšetření má, a dále vědět, že za určitých okolností nestačí obvyklé vložení tkáně do fixační tekutiny a odeslání na patologii.

5.3.1  Metody, vyžadující spolupráci s klinikem při odběru a fixaci tkáně

5.3.1.1  Elektronový mikroskop

Vyšetření elektronovým mikroskopem je dnes nezbytné v několika diagnostických disciplínách, zejména v nefropatologii a patologii metabolických onemocnění. Dále se uplatňuje v některých speciálních diagnózách.

Elektronový mikroskop umožňuje zobrazit tkáně ve velmi vysokých rozlišeních. Na druhé straně je nutné mít na paměti, že objem takto vyšetřené tkáně je jen velmi malý a proto je méně vhodný při vyšetřování heterogenních tkání.

Elektronový mikroskop lze využít i k určení výchozích typů tkání podle ultrastrukturálních znaků, ke specifikaci intracelulárních organel nebo depozit. Například u buněk hormonálně aktivních je možné určit produkovaný hormon z tvaru a velikosti vakuol skladujících příslušný hormon nebo jeho prekursor.

Využití elektronového mikroskopu v diagnostické patologii bylo v dnešní době do značné míry nahrazeno aplikací specifických protilátek. Pro speciální účely lze použít protilátkových detekcí i na úrovni elektronového mikroskopu.

Pokud se plánuje vyšetření elektronovým mikroskopem, je vhodné malou část tkáně fixovat glutaraldehydem. Rovněž je možné pro vyšetření elektronovým mikroskopem použít běžně fixovanou tkáň vyloupnutou z parafinového bločku.

5.3.1.2  Vyšetření přímou imunofluorescencí

Přímá imunofluorescence používá protilátky proti některým tkáňovým antigenům, nejčastěji proti depozitům imunoglobulinů (u autoimunitních onemocnění ledvin a kůže).

Protilátky bývají značeny fluorochromem. Nejčastěji se používá fluoresceinisothiocyanát (FITC). Pro průkaz je nutný mikroskop se zařízením pro fluorescenci.

Fluorescenční mikroskop je vybaven zdrojem světla (nejčastěji to je rtuťová nebo xenonová výbojka, v nouzi i halogenová lampa) a vhodnou kombinací excitačních a bariérových filtrů. Kombinace filtrů musí odpovídat použitému fluorochromu. Excitační světlo o nižší vlnové délce (světlo jiných vlnových délek je odfiltrováno excitačním filtrem) vede k emisi světla o vyšší vlnové délce. Excitační světlo je odfiltrováno bariérovým filtrem a emitované světlo lze pozorovat nebo fotografovat.

Tkáň pro vyšetření přímou imunofluorescencí zpravidla nelze fixovat (fixační tekutina vyplaví většinu deponovaných protilátek). Čerstvou tkáň je nutné zmrazit a řezy krájet ze zmražené tkáně.

Při vyšetření puchýře je nutné odebírat tkáň z okraje, tak, aby byl zachycen přechod částečně postižené tkáně do puchýře. Při vyšetření vaskulitidy je nutné odebrat tkáň brzy, léze nesmí být starší než 24 hodin (jen tak lze spolehlivě zachytit IgA, který je charakteristický pro purpuru Schönlein-Henoch).

5.3.1.3  Vyšetření nepřímou imunofluorescencí

Vyšetření nepřímou imunofluorescencí je spíše doménou vyšetření klinických. Zde uvádíme jen pro úplnost: nepřímou fluorescencí se prokazují autoprotilátky v séru pacienta. Sérum pacienta se nechá reagovat s normální tkání (v kožní patologii se používá například opičí jícen nebo morčecí tlamka). Tkáňový řez se po vhodné době opere od nenavázané protilátky a použije se značená protilátka proti protilátce; navázaná protilátka se prokazuje fluorescenčním mikroskopem.

5.3.1.4  Vyšetření histochemické (enzymy)

Tkáně obsahují značné množství enzymů. Jejich průkaz se využívá ke specifikaci tkáně (u enzymů tkáňově specifických) nebo k průkazu enzymatických deficiencí (například u některých metabolických vad).

Podstata těchto vyšetření spočívá v tom, že se enzymy nechají reagovat ve tkáňových řezech. Místo přirozeného substrátu se použije substrát modifikovaný tak, aby po reakci s enzymem došlo k barevné změně.

Enzymatické metody vyžadují ve většině případů zpracování čerstvé tkáně (nazmrzlo), protože většina enzymů při fixaci ztrácí aktivitu (denaturace spojená se změnou konfigurace bílkoviny enzymy deaktivuje).

Enzymatické metody se dnes využívají při zpracování biopsií kosterního svalu (typizace vláken, defekty reaktivity NADH tetrazolium reduktázy u ragged red fibres aj.), u průkazu enzymatických deficiencí u malabsorpčních syndromů a jinde.

Enzymatické metody se rozsáhle využívají u imunohistochemických vyšetření ke značení protilátek: protilátky, značené enzymem, se navážou na odpovídající antigeny ve tkáni. K jejich vizualizaci se použije modifikovaný substrát tak, jak bylo popsáno výše. Protože enzymy jsou navázány až na reagující protilátky, vyšetřovanou tkáň je možné běžným způsobem fixovat.

Obrázky

Příklad využití protilátky v bioptické diagnostice: metastáza adenokarcinomu v plíci, kde histologický obraz neumožňuje spolehlivé určení primárního tumoru. Bylo použito několika protilátek: CK20 (cytokeratin 20), který reaguje především s adenokarcinomy střeva, dále CK7 (který reaguje pozitivně s plicním epitelem) a TTF1 (reaguje pozitivně s epitelem plicním a epitelem štítné žlázy). Na reakci s CK20 je vidět pozitivní reakce v tumoru a negativní reakce okolní plicní tkáně, na reakci s CK7 je tomu naopak. TTF1 reaguje jen s okolní plicní tkání. Výsledek ukazuje na metastázu adenokarcinomu tlustého střeva do plíce:
Metastáza adenokarcinomu do plic, HE 60x (74255)

Metastáza adenokarcinomu do plic, CK20 60x (74253)

Metastáza adenokarcinomu do plic, CK7 60x (74254)

Metastáza adenokarcinomu do plic, TTF1 60x (74256)

5.3.2  Barvení používaná na běžné formalinem fixované tkáni

Na formalinem fixovanou tkáň lze použít řadu barvení. Rutinní barvení je barvení hematoxylinem-eosinem. Dále se často používá barvení PAS, van Gieson, trichromy, barvení na průkaz mikroogranismů, barvení na znázornění retikulinové kostry tkáně (Gömöry), barvení na amyloid, speciální barvení na pigmenty (hemosiderin, melanin, žluč) a mnoho dalších.

Speciální barvení se používají především v situacích, kdy barvení hematoxylin-eosin dává pro různé látky stejné výsledky.

Kromě toho je k dispozici řada protilátek vůči různým tkáňovým antigenům, ať normálním nebo antigenům přítomným pouze za patologických okolností.

Protilátky (ať již monoklonální nebo purifikované polyklonální) se používají na znázornění velkého množství antigenů. Některé antigeny jsou typické pro určité tkáně. Této vlastnosti se využívá k přesnému zařazení tumorů k výchozí tkáni: tak tumory vycházející z hladkého svalu budou reagovat pozitivně na aktin hladkého svalu, tumory z nervové tkáně budou exprimovat neuroektodermální antigeny a podobně.

Kromě toho existuje řada protilátek, které se různě vyskytují u tumorů navzájem v rutinních barveních dosti podobných. Tak například lymfocytární infiltráty umožnují odlišit nejen B a T lymfocyty, ale rozeznat i řadu dalších antigenů. O průkaz těchto antigenů se opírá moderní klasifikace lymfomů.

Kromě toho existují některé obecné markery, které se vyskytují v řadě tkání. Z jejich přítomnosti můžeme získat některé další, pro diagnostiku důležité informace. Tak například jaderná exprese Ki67 má vztah k buněčné proliferaci (nereaguje v jádrech ve fázi G0 mitotického cyklu).

Některé antigeny se dají prokazovat i v séru a jejich zvýšená hladina se uplatňuje v onkologickém screeningu (například PSA, prostate specific antigen, je zvýšený u tumorů prostaty v séru pacientů; patolog tento antigen využije zejména u metastáz nejasného původu k potvrzení nebo vyloučení původu z prostaty).

Přítomnost některých antigenů v určitých tkáňových strukturách je mimořádně důležitá. Tak například vývody mléčné žlázy mají na periferii vrstvu myoepiteliálních buněk. Tato vrstva se dá prokázat speciální protilátkou. U duktálních karcinomů tyto buňky chybí.

Obecně platí, že neexistují protilátky specifické pro jednotlivé tumory. Reaktivita protilátek není stoprocentní, některé tumory své antigeny neexprimují a naopak řada antigenů se vyskytuje v odlišných typech tkání. Dále se jedná o poměrně komlikované laboratorní metody, které někdy selhávají. Patolog tedy nemůže založit diagnózu pouze na přítomnosti tkáňových antigenů, ale vždy primárně hodnotit architektoniku tkáně a cytologické vlastnosti buněk v běžných barveních.

5.3.3  Vyšetření polarizačním mikroskopem

Polarizační mikroskop je vhodný v rutinní diagnostické mikroskopii na průkaz opticky aktivních struktur, mezi které patří zejména amyloid. Dále se využívá na průkaz cizorodých materiálů (křemík a sklo, některý stehový materiál a jiné cizorodé látky).

Metoda je jednoduchá: pod kondenzor se do osvětlovacího svazku světla vloží polarizační filtr. Ten polarizuje světlo do jedné roviny. Mezi objektiv a okulár se vloží analyzátor (rovněž filtr). Pokud se oba filtry zkříží, světlo za normálních podmínek prakticky neprochází. Pokud však jsou ve tkáni opticky aktivní látky, pootočí rovinu polarizovaného světla a zřetelně svítí na tmavém pozadí.

Toto vyšetření je jen orientační a zpravidla se nepoužívá k přesnému stanovení opticky aktivní látky. Úhel pootočení atd. se v rutinní diagnostické patologii neměří.



Na začátek této strany



Pokud atlas nefunguje jak má (například se neotevírají okna s obrázky), je možné, že jste se dostali do vnitřních oblastí atlasu přímým odkazem zvenčí a tak jste vynechali některé vstupní detekční procedury. Zkuste přejít na hlavní stránku atlasu: www.muni.cz/atlases