Po odběru klinik zpravidla vloží odebranou tkáň do fixační tekutiny. Pokud je předmět vyšetření maligní tumor, očekává se od patologa též zhodnocení kompletnosti excise (zhodnocení resekčních okrajů). Aby bylo možné toto vyšetření provést, je vhodné, aby zaslaná tkáň byla předána na patologii vcelku. Rozřezání tkání na kusy nebo i naříznutí tkání toto zhodnocení znemožňuje nebo komplikuje.
Jako fixační tekutina se zpravidla používá 10% roztok formaldehydu (někdy s různými přísadami). Tato fixační tekutina se však v některých případech nehodí, protože znemožňuje některá vyšetření (histochemické, vyšetření přímou imunofluorescencí). Proto je nutné v takových případech postupovat po dohodě s patologem.
Fixace tkáně formolem vede ke změnám konfigurace bílkovin, zejména enzymů. To vede k okamžitému zastavení autolytických procesů. Fixace tkáně trvá (podle velikosti vzorku) zpravidla 24 hodin. Rychlost průniku fixační tekutiny do tkáně je přibližně 1 mm za hodinu; malé vzorky jsou zfixovány rychle.
Mezi další fixační tekutiny patří například Methacarn, Bouin, glutaraldehyd (ten je pro elektronový mikroskop) a další.
Po fixaci (nebo před fixací) musí patolog tkáň důkladně prohlédnout a vybrat vhodné vzorky pro histologické vyšetření. Drobné vzorky se vyšetřují celé, z větších kusů tkání je nutné vybrat reprezentativní odběry tak, aby bylo možné zhodnotit charakter procesu, vztah k okolní (normální) tkáni u ložiskových procesů, kompletnost excize u maligních procesů (zda jsou resekční okraje tvořeny normální tkání nebo zda jsou prostoupeny tumorem. Odebíraná tkáň nesmí být nekrotická. Zejména u heterogenních tkání (například u některých tumorů) musí být množství odebraných vzorků velké.
Aby bylo možné přesně zhodnotit resekční okraje, povrch tkáně je vhodné obarvit (například tuší). Barvivo je patrné i v histologickém řezu a pokud proces zasahuje do zbarveného okraje, je jasné, že zasahuje i do okraje odebrané tkáně a resekce je hodnocena jako nekompletní.
Odběr vzorků je zodpovědná práce. Nevhodným způsobem odebrané vzorky mohou histologické zhodnocení omezit nebo i znemožnit.
Pro většinu orgánů jsou vypracovány vhodné postupy odběru vzorků tak, aby bylo možné tkáň odpovídajícím způsobem vyhodnotit (to platí především pro maligní tumory).
Při odběrech vzorků se patolog řídí také informacemi od kliniků, vhodným označením tkání a podobně. Správně vyplněná průvodka je pro kvalitní zpracování tkání velmi důležitá.V průběhu dalšího procesu je z tkáně odstraněna voda v alkoholu o vzrůstající koncentraci až po stoprocentní alkohol. Potom je tkáň převedena do xylenu a přenesena do rozehřátého parafinu, který postupně nahradí xylen.
Tento proces trvá řadu hodin (zpravidla přes noc). Na sycení tkání parafinem se používají automaty, kde košíky plné kazetek s tkáňovými vzorky jsou postupně přenášeny z jedné lázně do druhé.
Výsledkem celé operace je tkáň, kompletně prosycená parafinem. To jí dává vhodnou konzistenci pro krájení.
Kousky parafinem prosycené tkáně jsou zality do parafinových bločků. U některých tkání je důležitá orientace tkáně: je nutné, aby řez vedl v určité rovnině. U kožních excisí tak, aby byla kolmo zachycena epidermis, u nádorových lézí aby vyšetřovaná rovina zachytila přechod tumoru a okolní tkáně a podobně.
Po zalití do bločku jsou z bločků odkrajovány tenké řezy pro mikroskopické vyhodnocení. Pro krájení se používá zařízení zvané mikrotom. Velmi ostrý nůž nebo speciální žiletka odkrajuje z parafinového bločku plátky silné přibližně 5µm. Vhodná konzistence parafinového bločku se udržuje chlazením ledem.
Tenké řezy tkání jsou poté nalepeny na podložní skla.
Z řezů tkáně nalepené na podložní sklo je nutné vyprat parafin xylenem a pak se sestupnou řadou alkoholů řezy zavodní. Jedná se v podstatě o opačný proces než byl popsán výše.
Potom se řezy barví vhodnými barvivy (či spíše jejich kombinacemi). Standardně se pro naprostou většinu tkání používá kombinace barvení hematoxylinem a eosinem. V případě potřeby se používá jiných (speciálních) barvení.
Po obarvení se řezy opět ve vzestupné řadě alkoholů odvodní, zakápnou montovacím médiem (klasický je kanadský balzám, dnes se spíše používá syntetické montovací médium, např. Solakryl).
Poté se řezy překryjí tenkým krycím sklíčkem, přitisknou (nebo zatíží) a preparát je možné histologicky vyšetřit. Postupně montovací medium vyschne a krycí sklo se pevně přilepí.
Preparáty i parafinové tkáňové bloky je možné dlouhou dobu uschovávat v archivech. I po dlouhé době je možné pořídit nové řezy, použít nových speciálních metod a podobně. Archiv se tak stává zdrojem pro další diagnostickou a výzkumnou práci.
Úvod:
Za určitých okolností není možné formol parafinový proces použít. To nastává zejména za těchto okolností:
Odebraná tkáň je přikrojena, zorientována a dále co nejrychlejším způsobem zmražena, aby ji bylo možné krájet. Krájení probíhá v kryostatu, což je v podstatě v mrazničce uložený mikrotom. Teplota při krájení je přibližně -20 stupňů Celsia.
Zmražení tkáně musí probíhat co nejrychleji, aby se předešlo mrazovým artefaktům, způsobeným pomalým růstem krystalů ledu ve tkáni (čím rychleji se tkáň mrazí, tím větší krystaly se tvoří). Pro diagnostické účely pro peroperační biopsie se tkáň buď chladí na podchlazeném stolku nebo se používá proud kysličníku uhličitého. Pro speciální účely (například svalové biopsie) se tkáň bleskově mrazí na teplotu kapalného dusíku. To se provádí tak, že se tkáň ponoří do hluboce podchlazené kapaliny (tekutý propan butan nebo freon). Tkáň nelze ponořit do kapalného dusíku přímo, protože prudce vroucí kapalný dusík kolem tkáně vytvoří plynný obal, který prochlazení tkáně zpomaluje.
Peroperační biopsie je prováděna v časové tísni. Operace je přerušena dokud patolog nevyhodnotí tkáňový vzorek. Taková situace nastane například pokud je při operaci objeven proces, podezřelý z malignity. Podle charakteru procesu je modifikován rozsah operace. Podobně při operaci maligních tumorů chirurg po odstranění tumoru odebírá vzorky z resekčních okrajů. Pokud vyšetření okrajů prokáže residua tumoru, chirurg excisi rozšíří.
Podobná situace může nastat například při mastektomii pro maligní tumor. Současně s resekcí tumoru se odebírají lymfatické uzliny v axille. Podle výsledku průběžného vyšetření odebraných uzlin chirurg v odebírání uzlin dále pokračuje nebo výkon ukončí.
Vzhled preparátů připravených technikou nazmrzlo se liší od běžných formol parafinových preparátů. Řezy jsou zpravidla silnější, orientace je horší a diagnostické hodnocení nemusí být vždy jednoznačné a s definitivní diagnózou je nutné vyčkat na trvalé preparáty.
Uvádíme ukázky některých, zejména nádorových, biopsií a srovnání peroperačního vyšetření na zmražené tkáni s preparáty po klasickém parafinovém procesu.
Obrázky
Ganglioneuroblastom:
Ganglioneuroblastom smíšený, HE nazmrzlo 20x (72625)Ganglioneuroblastom smíšený, HE 40x (72626)
Glioblastoma multiforme:
Glioblastoma multiforme, HE nazmrzlo 40x (72627)Glioblastoma multiforme, HE 40x (72628)Glioblastoma multiforme, HE 40x (72629)
Prekurzorový lymfom:
Prekursorový lymfom, HE nazmrzlo 40x (72646)Prekursorový lymfom, HE 100x (72645)
Zralý multicystický teratom:
Multicystický zralý teratom, tridermom, HE nazmrzlo 20x (72652)Multicystický zralý teratom, tridermom, HE 40x (72653)
Pilocytární astrocytom:
Pilocytární astrocytom, HE nazmrzlo 20x (72654)Pilocytární astrocytom, HE nazmrzlo 40x (72655)Pilocytární astrocytom, HE 40x (72656)
Ewingův sarkom:
Ewingův sarkom, HE 40x (72657)Ewingův tumor, HE nazmrzlo 40x (72672)
Fixace a parafinový proces naruší některé tkáňové struktury. Typicky se jedná o enzymy (svalová biopsie, biopsie při malabsorbčním syndromu a jiné), některé antigeny a další struktury.
Dnes je k dispozici velké množství protilátek, které pracují na běžně fixovaných a zpracovaných tkáních, proto pro diagnostické účely již speciální postupy při zpracování tkání nejsou nutné.
Některé látky se při fixaci a formol parafinovém procesu z tkáně vyplaví. Jedná se částečně o glykogen, kyselinu močovou, některé deponované protilátky a zejména o neutrální lipidy (tuk, cholesterol).
Intra- i extracelulárně uložený tuk je za některých okolností diagnosticky důležitý (Reyůvy syndrom, jaterní steatóza, necrobiosis lipoidica, špatně diferencované liposarkomy). Pro průkaz tuku lipofilním barvivem (Sudan, olejová červeň) je nutné vynechat parafinový proces a barvit zmraženou tkáň (na fixaci nezáleží).