Úvod:
Molekulární patologie je založena na detekci zvolených sekvencí bazí nukleových kyselin. Laboratorně připravená komplementární sekvence je označena (nejčastěji fluorescenčním barvivem) a nechá se proběhnout reakce s nukleovou kyselinou ve tkáni.
Nukleové kyseliny je ve tkáni zpravidla málo, proto se napřed příslušné úseky nukleové kyseliny ve tkáni namnoží řízenou polymerázovou reakcí (která in vitro napodobuje normální proces duplikace nukleové kyseliny).
Protože je známo, že řada onemocnění je provázena typickými změnami v genomu (translokace), ve kterých se úseky nukleových kyselin dostávají do sousedství úseků jiných, jsou některé metody založeny právě na tomto faktu: detekční úsek nukleové kyseliny funguje jako přemostění a naváže se právě při typických translokacích. Dále se k detekci translokačních změn používá metody FISH.
Pro efektivnější využití vyšetřovaných tkáni a reagencií a ušetření času se používají tzv. tissue arrays: na jedno sklo je umístěno velké množství vzorků a na všechny se nanese protilátka. Nebo naopak na skle je naneseno velké množství známých sekvencí nukleových kyselin a takové sklo se nechá reagovat s vyšetřovanými nukleovými kyselinami. Taková skla (nebo jiné materiály) jsou komerčně dostupná. Při vyhodnocení míst, kde došlo k vazbě, lze využít počítači řízené automaty. Tak lze prokázat hledanou (předem známou) sekvenci nukleové kyseliny velmi rychle. Vzhledem k volné dostupnosti kompletních sekvencí lidského genomu a rostoucím informacím o změnách v nukleových kyselinách při určitých chorobách je toto vyšetření velmi perspektivní.
Obrázky
Tissue array (vzorky tkání z různých tumorů, na které byla aplikována protilátka):
Tissue array, imuno 20x (71860)
Úvod:
Smyslem PCR je namnožení specifických úseků nukleové kyseliny vyšetřovaného vzorku. Je možné vycházet i z nepatrných množství vzorku (izolované buňky). Existují metody, jak z histologického řezu získat jednu buňku určitého typu a její nukleovou kyselinu podrobit PCR amplifikaci.
Metoda:
Cyklus se opakuje v průběhu asi 2 hodin až 30×, což vede k exponenciálnímu nárůstu specifických úseků nukleové kyseliny ve vyšetřovaném vzorku. Průkaz těchto úseků se provádí gelovou elektroforézou (vždy spolu s kontrolními vzorky a negativní kontrolou).
Metoda má mnohostranné použití:
Úvod:
Značená sonda, tvořená specifickým známým úsekem nukleové kyseliny, reaguje ve tkáni. Sonda navázaná na komplementární úsek nukleové kyseliny ve tkáni se poté různými metodami prokazuje. Metoda je analogická metodám protilátkovým.
Metoda:
Takto se prokazují antigeny některých tumorů, virová nukleová kyselina a další.
Úvod:
Při této metodě lze použít více sond značených různými fluorochromy. Hodnotí se vzájemná poloha a počet navázaných sond v buněčném jádře.
Metoda:
Při této metodě se vážou různé sondy na různá místa genomu, přičemž každá sonda je značena jiným fluorochromem (a svítí jinou barvou). Tak je možné hodnotit vzájemnou polohu prokazovaných úseků DNA. Mikroskop musí mít více fluorescenčních filtrů pro odpovídající fluochromy. Hodnocení je založeno na barevném skladu: pokud jeden z fluochromů svítí např. zeleně a druhý červeně, tak pokud se ocitají po translokaci v sousedství, výsledný bod svítí jinou barvou (žlutě) nebo jsou aspoň oba body těsně u sebe. Takové vyšetření vyžaduje speciální fluorescenční mikroskop s automatickou výměnou fluorescenčních kombinací filtrů. Kamera sejme dílčí obrazy při různých vlnových délkách a výsledný obraz je složen počítačem.
Úvod:
Jedna z nejnovějších technologií, kde na nosiči (zpravidla na podložním skle) je naneseno velké množství vzorků (sond) DNA. RNA z testované tkáně se nechá se vzorky hybridizovat a vazba se prokazuje fluorescenčně nebo radiograficky.
Tato metoda je prozatím v počátcích, předpokládá se však, že v horizontu 10 let povede k zpřesnění diagnostiky a bude mít zásadní přínos i při léčbě.
Metoda:
Na podložní sklo se nanesou vzorky jednopramenné DNA (delší cDNA nebo cca 25 párů bazí dlouhé oligonukleotidy, které je možné též sestavovat fotolithograficky přímo na skle). cDNA sond lze nanést na sklo až 10 000, oligonukleotidů až 250 000. cDNA sondy jsou na skla nanášeny roboticky ve formě nepatrných teček, každá o velikosti kolem 100µm. Při hledání vhodných oligonukleotických sond se vychází z dat získaných při analýze a čtení lidského genomu.
Testovaná RNA pochází z tkáně, biopticky odebrané. Protože je tkáň směsí různých druhů buněk, lze u heterogenních vzorků odebrat jen vybrané buňky metodami laserové mikrodissekce (a to i z formalinem fixované tkáně po parafinovém procesu). RNA se reverzně transkribuje na cDNA. Vzniklá cDNA je označena fluochromem (nebo radioaktivním izotopem fosforu, zejména u microarrays s oligonukleotidy).
Označená cDNA se nechá reagovat se sondami na skle. Pro vyhodnocení se používá snímačů (založených na laserovém konfokálním mikroskopu). Získané obrazy se hodnotí pomocí speciálního analytického software, které vyhledá pozitivně reagující sondy. Struktura sond je známa (souřadnice každé mikrotečky s cDNA sondou je známa).
Výsledky se analyzují statisticky metodami shlukové analýzy. Tak je možné sledovat přítomnost a stav genů kódujících nejrůznější celulární struktury (enzymy, receptory, regulátory atd.) a nález korelovat s chorobou, jejím typem, aktivitou atd.
Mikrodissekční metody umožňují vyjmout z tkáňového řezu určité oblasti (v ideálním případě jednotlivé buňky) a takto odejmutý materiál použít pro další zpracování metodami molekulární patologie (například amplifikace a další zpracování DNA takto vybraných buněk). Výhoda je přesné cílení na buněčný typ ve tkáni, skládající se ze směsi buněčných typů (nádorových i nenádorových). Takto lze například zpracovat samostatně Hodgkinovy buňky.
Nejběžnější je terminační metoda (Sanger): v reakční směsi jsou kromě DNA polymerázy, primerů a normálních desoxynukleotidů také modifikované desoxynukleotidy: didesoxynukleotidy. Ty mají tu vlastnost, že po zabudování didesoxynukleotidu další syntéza DNA fragmentu okamžitě končí.
Didesoxynukleotidy jsou přítomny ve všech čtyřech variantách (odpovídajících normálnímu A,T,C,G) a jsou označeny fluorochromy (každý jiným, takže později je možné je rozlišit).
Reakce se nechá probíhat cyklicky běžným způsobem, takže zabudování nukleotidů probíhá náhodným výběrem mezi nukleotidem normálním a modifikovaným. Výsledkem je směs fragmentů nukleové kyseliny různé délky, které vždy končí modifikovaným nukleotidem.
Tato směs se podrobí gelové elektroforéze, která směs rozdělí podle délky jednotlivých fragmentů. Poté se na každý proužek elektroforetického gelu posvítí různými vlnovými délkami světla, které odpovídají absorpční charakteristice fluorochromu značícího ten či onen modifikovaný nukleotid (který je zabudovaný v každém fragmentu právě jeden, a to na konci). Tak lze zjistit, kterým nukleotidem je fragment ukončen.
Protože jsou fragmenty elektroforézou uspořádané podle délky, výsledek odpovídá sekvenci jednotlivých nukleotidů nukleové kyseliny.
Pro tuto metodu se používá počítačem řízených automatických procesorů. Další počítačové zpracování zajistí zařazení daného fragmentu nukleové kyseliny do celkového kontextu čtené DNA sekvence.